生化培養(yǎng)箱中的大腸桿菌的檢測方法

大腸菌群測定的操作細(xì)則大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。

　　食品中大腸菌群數(shù)系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群可能數(shù)（MPN）表示。

　　1 設(shè)備和材料1.1 生化培養(yǎng)箱：恒定溫度36±1℃。

　　1.2 冰箱：0～4℃。

　　1.3 恒溫水浴 :44.5±0.5℃。

　　1.4 天平。

　　1.5 顯微鏡。

　　1.6 均質(zhì)器或乳缽。

　　1.7 平皿：直徑為90mm。

　　1.8 試管。

　　1.9 吸管。

　　1.10 廣口瓶或三角燒瓶：容量為500mL。

　　1.11 玻璃珠：直徑約5mm。

　　1.12 載玻片。

　　1.13 酒精燈。

　　1.14 試管架。

　　2 培養(yǎng)基和試劑2.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管：按GB 4789.28中4.9規(guī)定。

　　2.2 伊紅美藍(lán)瓊脂平板：按GB 4789.28中4.25規(guī)定。

　　2.3 乳糖發(fā)酵管：按GB 4789.28中4.10規(guī)定。

　　2.4 EC 肉湯：按GB 4789.28中4.11規(guī)定。

　　2.5 磷酸鹽緩沖稀釋液：按GB 4789.28中3.22規(guī)定。

　　2.6 生理鹽水。

　　2.7 革蘭氏染色液：按GB 4789.28中2.2規(guī)定。

　　3 操作步驟3.1 檢樣稀釋3.1.1 以無菌操作將檢樣25mL（或g）放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣用均質(zhì)器，以8 000-10 000 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。

　　3.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。

　　3.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。

　　3.1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種3管。

　　3.2 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖 膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1℃ 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。

　　3.3 分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃ 溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18-24h,然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。

　　3.4 證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置 36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。

　　3.5 報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。

　　4 糞大腸菌群（faecal coliform）4.1 用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物（見3.2條）轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)，置44.5±0.2℃水浴箱內(nèi)（水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面），培養(yǎng)24±2h,經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置 培養(yǎng)18-24h,凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽性。

　　4.2 結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）糞大腸菌群的MPN值。